“Señalamiento y captura del ARN largo no codificante Catsper1au y sus factores asociados utilizando el sistema de antiterminación transcripcional del bacteriófago mEp021.”
Antecedentes. Actualmente el estudio de los ARN no codificantes ha demostrado tener funciones reguladoras en las células. De estos se han descubierto una gran variedad, entre ellos los ARN largos no codificantes (ARNlnc) capaces de unirse o interaccionar con otras moléculas como factores transcripcionales, otros ARN´s y ADN para regular sus funciones. Los ARNlnc regulan la expresión y traducción de múltiples genes relacionados con enfermedades cardiovasculares, neurodegenerativas, osteoporosis, y varios tipos de cáncer. En este estudio se plantea señalizar el gen del ARNlnc Catsper1au (gen divergente a Castper1, determinante de fertilidad masculina) con una secuencia específica para una proteína de unión al ARN. En colaboración con el Dr. Luis Kameyama, se utilizará el sistema de antiterminación transcripcional del bacteriófago mEp021, que consiste en una proteína antiterminadora gp17 capaz de unirse a una secuencia de ARN especifica, BoxB de nutR1. Se comprobará el funcionamiento de esta nueva estrategia para la recuperación del complejo gp17_BoxB_ARNlnc en transfecciones de células con las construcciones plasmídicas, y si representa alguna ventaja en la captura de factores asociados al ARNlnc, que podrían explicar la función de este ARNlnc y que pueda utilizarse en otros ARNlnc.
Objetivo: Establecer un sistema de señalamiento y captura para el ARNlnc Catsper1au y sus factores asociados utilizando el sistema de antiterminación transcripcional del bacteriófago mEp021.
Material y métodos: La estrategia de clonación de la secuencia BoxB en el gen del ARNlnc Castper1au Será diseñada sin alterar la estructura secundaria del ARNlnc. Para esto se realizaran simulaciones bioinformáticas para analizar las estructuras del ARN al incorporar el BoxB en el extremo 5´o 3. Una vez diseñada la estrategia se procederá a clonar el gen Catsper1au junto con la secuencia BoxB en el vector pcDNA3 de expresión para células eucariontes. El gen de la proteína gp17 ya ha sido previamente clonada junto con un tallo de histidinas que permite su purificación en columnas de afinidad de níquel. La construcción del ARNlnc Catsper1au-BoxB será transfectado en células para expresar la molécula señalizada, la cual será verificada por RT-PCR para confirmar su expresión. A partir de las transfecciones se purificará el ARN total de las células y se procederá a optimizar el procedimiento de captura del BoxB-ARNlnc en columnas que tengan acoplada la proteína gp17-His. El ARN retenido será recuperado de las columnas y convertido en cDNA y se verificara por PCR la presencia de Catsper1au. Esto nos permitirá continuar los ensayos de captura del ARNlnc Catsper1au, pero bajo condiciones de entrecruzamiento de ARN con proteínas, ARN-ARN y ARN-ADN para analizar los factores asociados con el Catsper1au.
Las proteínas asociadas serán analizadas en geles de SDS-PAGE, se verificara su tamaño y las bandas serán recortadas para enviarlas a un análisis por espectrometría de masas que permita identificarlas. El ARN será sintetizado en ADNc y con oligos al azar se sintetizará la segunda cadena para ser clonado en un vector receptor de productos de PCR y los candidatos obtenidos serán identificados por secuenciación. En el caso del ADN será tratado para generar extremos lisos, ligarlo con adaptadores y clonarlo directamente en un vector para su posterior secuenciación. Se identificaran los posibles motivos de unión en las secuencias obtenidas del ADN y ARN aisladas. Los genes y proteínas identificadas serán analizados en sus funciones y procesos biológicos en los que participan, así como su participación en rutas metabólicas comunes.
