CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DEL ARN LARGO NO CODIFICANTE (Catsper1au) EN LA REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA DE LA ESPERMATOGÉNESIS.
Antecedentes
Las células germinales masculinas producen ARN mensajeros únicos los cuales no tienen similitud con ningún otro transcrito de células somáticas, como los genes del canal CATSPER. CATSPER es un canal catiónico conformado de 4 proteínas principales y otra accesorias, fue detectado exclusivamente en la región principal del flagelo de espermatozoides. Este canal es necesario para la hiperactivación de la motilidad y la fertilidad ya que se requiere para penetrar la zona pelúcida que rodea el ovocito. La disrupción de los genes de la familia Catsper resulta en un canal no funcional que conduce a una hiperactivación deficiente y a la infertilidad masculina. Esto lo convierte en un blanco ideal para el desarrollo de un anticonceptivo no hormonal para bloquear el canal sin producir efectos secundarios. Sin embargo, no ha sido posible reconstituir este canal en un sistema in vitro de expresión heterólogo lo que dificulta el estudio de fármacos antagonistas que pudieran bloquearlo.
Debido a la importancia del canal CATSPER en la biología de la reproducción nuestro grupo trabaja con el promotor del gen Catsper1 tanto de ratón como de humano para conocer sus mecanismos de regulación. Así, se encontró que los factores SRY y CREB regulan el promotor de CATSPER1 humano y Sox5 y Sox9 al de Catsper1 murino.
Asimismo, se observó que el promotor del gen Catsper1 murino es bidireccional in vitro en células espermatogénicas expresando en sentido a Catsper1 y en antisentido a un nuevo gen. Este nuevo gen nombrado Catsper1au [gen río arriba y en antisentido a Catsper1, número de acceso en NCBI: KX825862]. Al igual que Catsper1 se expresa en gonadas masculinas, exclusivamente en el núcleo de células espermatogénicas y de Sertoli. Lo anterior y el hecho de que no es traducido in vitro indican que Catsper1au es un ARN largo no codificante (ARNlnc). Los ARNlnc derivados de promotores bidireccionales pueden regular positiva o negativamente la expresión de su gen vecino que codifica para una proteína. Esto hace factible que el ARNlnc Catsper1au regule la expresión de Catsper1 y que afecte la hiperactivación del espermatozoide y su capacidad de fertilización.
Así, en este trabajo se plantea determinar si Catsper1au regula positivamente la expresión de Catsper1 y/o de otros genes involucrados en la espermatogénesis y si esto repercute en la hiperactivación del espermatozoide y la fertilidad.
Objetivo
Determinar el papel del lncRNA CatSper1au en la expresión del gen divergente Catsper1 murino y su función en la espermatogénesis y en la fertilidad.
Material y métodos
Con este fin se procedera a silenciar la expression del gen ARNlnc CatSper1au mediante la utilización de oligos antisentido protegidos transfectados en la línea celular espermatogénica GC1spg. Se analizará por PCR de tiempo real la disminución en el transcripto de CatSper1au. Una vez verificado el silenciamiento se obtendrán las muestras para ARNseq y se analizará el cambio en los niveles de expresion génica de los genes Catsper y/o de otros genes. Se identificarán las proteínas que podrían interactuar con el ARNlnc Catsper1au para regular a Catsper1 u otros genes mediante Northwestern blot y “Pulldown” por afinidad de ARN. Las proteínas que interaccionan con el ARNlnc Catsper1au seran identificadas por espectrometría de masas. El papel de Catsper1au en la hiperactivación de los espermatozoides y la fertilidad se analizará en ratones transfectados con los oligos para silenciar CatSper1au. De los cuales se verificará el por seguimiento de los genes desregulados con PCR de tiempo real. Los ratones silenciados en Catsper1au seran analizados en la hipertactivación de sus espermatozoides y serán cruzados con hembras para analizar la afectación en su capacidad reproductiva. Se espera que los ratones silenciados en CatSper1au sean infértiles debido a una possible disminución en la hiperactivación de los espermatozoides. El estudio abrirá nuevos horizontes en el área de la fertilidad y permitirá proponer estrategias para silenciar a Catsper1au y así abatir la expresión de Catsper1, como un posible método anticonceptivo masculino.
