Efecto de la combinación de Sorafenib, Ácido valproico y Metformina en un xenotransplante fluorescente de hepatocarcinoma
Marco teorico:
El hepatocarcinoma ocupa entre los pacientes diagnosticados con cáncer en México, el octavo y sexto lugar en incidencia y mortalidad respectivamente. Los tratamientos actuales para los pacientes con esta enfermedad incluyen el uso del fármaco Sorafenib, un inhibidor de tirosinas cinasas que incrementa la sobrevida en un promedio de dos a tres meses. Con la finalidad de incrementar la sobrevida del tratamiento, se han realizado investigaciones al combinar Sorafenib y otros fármacos utilizados en patologías diferentes al cáncer como el Ácido valproico y la Metformina. Estos fármacos, cuyas propiedades anticancerígenas han sido previamente reportadas, permiten su reposicionamiento hacia el posible uso en tratamiento combinado. Nuestro abordaje es un estudio in vitro e in vivo usando un modelo celular de hepatocarcinoma, que nos permita evidenciar los efectos farmacológicos combinados.
Objetivos:
General
• Evaluar el efecto de la combinación de Sorafenib, Ácido valproico y Metformina sobre la masa tumoral de un xenotransplante fluorescente de hepatocarcinoma en un modelo animal.
Específicos
• • Determinar el efecto de la combinación farmacológica sobre la muerte celular de la línea celular HepG2.
• Cuantificar el nivel de expresión de proteínas relacionadas con la muerte celular por efecto del tratamiento farmacológico combinado.
• Determinar el estado de activación de blancos moleculares relevantes en la vía de señalización farmacológica por efecto del tratamiento combinado con sorafenib, ácido valproico y metformina.
• Evaluar la eficacia del tratamiento combinado sobre el volumen tumoral de un xenotrasplante fluorescente de hepatocarcinoma.
Material y métodos:
Se utilizará la línea celular HepG2 como modelo celular de hepatocarcinoma humano. Se evaluará la muerte celular mediante ensayos de exposición de fosfatidilserina por citometría de flujo, fragmentación del DNA por electroforesis en gel de agarosa y ensayos de condensación de la cromatina por tinción nuclear con DAPI. La determinación de la muerte reproductiva se llevará a cabo a través de ensayos clonogénicos. Se realizará la cuantificación de la expresión de proteínas relacionadas con la muerte celular mediante el kit Human Apoptosis Antibody Array y los resultados serán confirmados mediante inmunodetección en fase sólida. Se cuantificará el nivel de expresión de blancos moleculares involucrados en la vía de señalización farmacológica por medio de inmunodetección en fase sólida. Se generará una línea celular estable fluorescente de hepatocarcinoma humano, a través de la transfección de un vector plasmídico recombinante que contenga la proteína GFP y el gen Neo como marcador de selección. Se evaluarán parámetros funcionales como emisión de fluorescencia y respuesta al tratamiento farmacológico in vitro. Se realizará un xenotransplante subcutaneo de la línea celular fluorescente en ratones inmunodeficientes C57BL/6 que serán tratados con el combinado farmacológico durante 21 días. Simultáneo al tratamiento, se cuantificará el volumen tumoral, peso del ratón y mortalidad/supervivencia. Al término del tratamiento, se sacrificará a los ratones y se recuperarán muestras de suero para cuantificación del nivel de expresión de la proteína VEGF. Se tomarán muestras de hígado y páncreas para tinción hematoxilina/eosina y para inmunodetección en fase sólida de los blancos moleculares involucrados en la vía de señalización farmacológica. Las pruebas estadísticas aplicadas serán t de Student para el ensayo de citometría de flujo, el ensayo clonogénico y los ensayos de cuantificación de proteínas. Para las variaciones intergrupales en los parámetros de volumen tumoral y peso del ratón, se aplicará un ANOVA de una vía.
