Evaluación del efecto protector de la Tiorredoxina 1 sobre la apoptosis inducida en células beta por glibenclamida
Antecedentes y Objetivo: La Diabetes mellitus (DM) es un desorden metabólico crónico caracterizado por altos niveles de glucosa en sangre. La DM tipo 2 es causada por la baja producción de insulina o por la resistencia de las células del cuerpo a la acción de dicha hormona. La DM tipo 2 es la forma más frecuente, representando al menos el 90% de los casos totales. Se estimó en el 2013 que 8.7 millones de mexicanos entre 20 y 79 años desarrollaron DM. Para normalizar los niveles de glucosa en los pacientes con DM se administran terapias combinadas con diversos fármacos, usando principalmente las biguanidas (metformina), sulfonilureas (glibenclamida) e insulina. A pesar del amplio uso y potente efecto de las sulfonilureas disminuyendo los niveles de glucosa en sangre, han surgido preocupaciones debido a que diversos estudios han demostrado que la glibenclamida induce la muerte de las células beta del páncreas bajo ciertas condiciones; aunque el mecanismo aún no ha sido determinado. Uno de los eventos que está involucrado en la muerte de estas células es el estrés oxidativo; ya que se ha demostrado que la glibenclamida estimula la producción de especies reactivas de oxígeno mediante la activación de la enzima NADPH oxidasa y consecuentemente causa apoptosis de células beta in vitro. El estrés oxidativo es un complejo mecanismo controlado por múltiples enzimas que regulan el delicado balance entre la producción y eliminación de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno. Estas especies reactivas oxidan diversas proteínas necesarias para la supervivencia de las células beta. Una de las enzimas importantes para mantener el equilibrio Redox, es la Tiorredoxina 1 (Trx1). La Trx1, mediante su actividad de óxido-reductasa, regula ciertas proteínas involucradas en la vía de apoptosis. Debido al incremento en el estrés oxidativo generado durante la exposición a glibenclamida, en este proyecto se plantea evaluar el efecto de la Trx1 sobre la apoptosis inducida en células beta por glibenclamida. Los grupos de estudio analizados serán células -TC-6 expresando niveles basales de Trx1 y células -TC-6 sobreexpresando Trx1; ambos grupos expuestos a 10M de glibenclamida por 48 h. Las células -TC-6 serán infectadas con un virus que contiene la secuencia codificante de la Trx1, la cual se detectará por RT-PCR y por western blot. El efecto protector de la Trx1 se evaluará determinando la apoptosis mediante la técnica de TUNEL para medir el grado de fragmentación del DNA, mediante citometría de flujo para evaluar la integridad de la membrana celular con ioduro de propidio y mediante western blot para medir la activación de caspasa-3 en células -TC-6 cultivadas in vitro. Los experimentos se realizarán por triplicado y se analizarán con el programa SigmaPlot. En el laboratorio contamos con cuarto de cultivo para manipular las células -TC-6 in vitro. Además, se cuenta con el virus que dirigirá la expresión de a Trx1 en las células -TC-6. También disponemos de los reactivos necesarios para realizar la técnica de TUNEL en las células -TC-6 y evaluar la apoptosis inducida por glibenclamida. Nuestro grupo tiene experiencia en el campo de la Biología Molecular y estrés oxidativo lo que nos permitirá desarrollar el presente proyecto en un plazo de 1 año y medio.
